FDA是美国食品药品监督管理局(U.S.Food&Drug Administration)的简称，是美国食品与药品管理的最高执法机关，世界各国都会在一定程度上参考或依据FDA的相关法规来评估本国食药类产品的安全。 FDA召回则是一种对于不合格产品采取的撤回弥补行为，被召回的产品大致分为以下几类：食品（包括个人护理产品）、药品、生物制剂、设备、兽药。 今天小编将对2013-2019年FDA药品召回事件中，涉及微生物污染的召回事件进行一个简单的回顾性分析。 微生物相关的召回事件占总事件的比例变化 2013-2019年药物召回共有2327起，其中共有401起召回涉及微生物，占药品召回总数的17.23%。涉及微生物的召回药品中，无菌产品284起，非无菌产品117起。其中大部分的召回原因是缺乏无菌保证，有267起。 在微生物相关的召回事件中的无菌产品和非无菌产品的召回次数 在非无菌产品是指可以接受微生物存在的产品，但是产品中的微生物数量不能超过一定限度（微生物数量超限表明产品的生产环境或生产过程可能不受控）且不得检出法规明确规定的控制菌以及“不可接受微生物”。 在117起非无菌产品的召回中，55起召回并未注明具体的污染微生物物种；在注明污染物种的召回中，真菌（酵母/霉菌）和细菌污染分别占19%和32%。而细菌污染中占比最大的污染菌为Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体），比例达到30.67%。其他曾在非无菌产品召回中出现过的细菌有：Escherichia. coli（大肠埃希氏菌）、Pseudomonas sp.（假单胞菌属）、Sphingomonas paucimobilis（少动鞘氨醇单胞菌）、Serratia liquefaciens（液化沙雷氏菌）、Staphylococcus warneri（沃氏葡萄球菌）、Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎克雷伯氏菌）、Bacillus circulans（环状芽孢杆菌）、Variovorax paradoxus（争论贪噬菌）、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）等。 非无菌产品微生物相关召回中污染菌的类型 非无菌药品微生物污染召回的相关法规 在《中国药典》2015版第四部和美国药典《USP》中，都有非无菌药品在微生物检查方面的相关规定，例如在“非无菌药品的微生物限度检查”中，明确根据给药途径规定了一些控制菌，其中包括大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等；另外，对于药品中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数也有相关的规定。 在本次统计的FDA召回的非无菌产品中，Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体）污染是涉及召回次数最多的微生物，在2004~2011年的非无菌产品汇总中，Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体）也是召回产品中污染占比最高的菌。 起初，Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体）并未被列入控制菌范围内，它对药品的潜在威胁性是在2018年9月底举行的PDA/FDA会议中被提出的。目前，在2019年12月1日生效的《美国药典》中，已经将Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体）纳入了控制菌检查项目。 如何判定是否为“不可接受微生物”？ 我们不能因为某些人吃海鲜过敏而禁止所有人食用海鲜，同样的，不能因为药品中存在微生物对于某些人群有害而禁止所有人使用，因此对于是否判定为“不可接受微生物”对于不同的药品生产厂家可能也需要有更为详细的考量因素，例如：药品的给药途径、药品的特性（是否促进微生物生长或者是否有足够的抑制微生物生长能力）、药品的使用方法、用药人群（如新生儿、婴幼儿及体弱者，风险可能不同）、患者使用免疫抑制剂和甾体类固醇激素等药品；存在疾病、伤残和器官损伤等。 在21 CFR 211.84(d)(6) ，21 CFR 211.113(a)，21 CFR 211.165(b)提供了对“不可接受生物”的一些指导原则。不过，这些指导原则并未对”不可接受微生物“做出定义。监管机构也不提供“不可接受微生物“的列表，而是希望生产厂商通过分析来决定自己产品里的“不可接受微生物“，并进行相应的质量控制。 在cGMP（动态药品生产管理规范）中，对“不可接受微生物”也没有进行详细的规定，但是其一般具有以下几个属性： 首先，这个概念是针对非无菌产品的。对无菌产品而言，所有的微生物都不可接受； 其次，不可接受微生物是产品特异的。可在特定的产品中增殖，对该药品的化学、物理、功能和治疗属性产生不利影响的微生物； 另外，在产品中有足够的数量并因具有致病性而在给药时可导致患者感染的微生物，也被认为是不可接受的。 在《中国药典》2015版第四部提到：对于原料、辅料及某些特定的制剂，根据辅料及其制剂的特性和用、制剂的生产工艺因素，可能还需检查其他有潜在危害的微生物，可见药典中也没有详细列出哪些是“不可接受微生物”。 以Burkholderia cepacia（洋葱伯克霍尔德氏菌）为例，该菌是一种严重的机会性人类病原体，参与囊性纤维化患者的感染，且对多种抗生素有耐药性，且在一些消毒剂、防腐剂中也能找到该菌的存在，对于免疫力较强的健康人可能不致病，但是对于新生儿、晚期老年和囊性纤维化患者(包括其他患者)尤其危险，如果药物是用于这类人群则不应有Burkholderia cepacia（洋葱伯克霍尔德氏菌）存在，另外也不应存在于用于鼻腔通道或者肺部的药物中。 那么除了Burkholderia cepacia complex（洋葱伯克霍尔德复合体），是否可能存在其他“不可接受微生物”？还有哪些条件致病菌也可以被列为特定类型药品的“不可接受微生物”？ 与其被动的等待微生物污染事件爆发后的总结归纳，我们更应该做的是防范于未然。通过对生产环境和产品进行一定水平的微生物监测，结合临床等其他信息，尽可能的去识别和发现那些可能对药品质量或者人体健康存在重要影响的微生物，并将它们纳入“不可接受微生物”控制列表，从源头上扼制可能发生的危害，以避免患者的生命健康受到威胁，也避免对医药企业自身造成经济损失。 “ 长按二维码 吧

在上一期，我们回顾FDA药品召回时，可以发现有不同类型的微生物与药品召回相关。除了革兰氏阴性细菌（如Burkholderia cepacia complex洋葱伯克霍尔德复合体）外，真菌污染也是召回的主要原因之一。（传送门） 这类召回主要与非无菌药品相关，真菌污染可能导致药品的有效成分失活，药品保质期缩短，也可能威胁患者健康。导致真菌污染的原因主要有生产设施的设计缺陷、生产过程控制不足或材料缺陷。 接下去要给大家分享的这篇文章所要讨论的就是生产设施设计和运行问题引起的真菌污染。 文章主要内容 文中提到，在真菌引起的召回事件中，监管机构似乎更关注药品洁净室中的真菌污染问题。在GMP检查、FDA警告信等监管机构的调查报告中，药品洁净室、冷藏室和受控区域的真菌污染问题经常被提及。 洁净室需要特别关注真菌的原因，主要是它们会产生孢子，一旦在某个区域检测到这些孢子，就说明真菌孢子已经无处不在了。因为它们相对容易传播，且很难被清除。真菌主要有酵母、丝状真菌或同时具有前述两种状态的真菌，如白色念珠菌（被称为双相真菌）。 文章先回顾了一些召回事件，以便了解污染问题的背景，然后聚焦于真菌污染溯源，从真菌的特性、需要被关注的潜在污染区域、影响污染引入的可能因素等角度展开了一系列的研究，并对于制药生产环境监控中真菌污染呈现上升趋势的问题，提出了一些纠正措施和预防措施。 真菌污染引起的药品召回 在药品生产环境中的真菌可能来源于空气、水、人员和各种的原料。多年来，已有许多真菌问题在药品洁净室、冷藏室和受控区域被报道。无菌药品和非无菌药品均受到了影响。其中，最臭名昭著的无菌药品真菌污染案例可能是2012年的新英格兰合成药物中心受污染的药物导致脑膜炎疫情大爆发。 由于缺乏环境管控和设施设计，导致了如Exserohilum rostratum（嘴突脐孢） 、Aspergillus fumigatus （烟曲霉）以及洁净室常见的霉菌Cladosporium （芽枝霉属）的部分种等真菌的生长和繁殖。 不过，主要受影响的还是非无菌药品。下面列举了一些曾被召回产品的类型，信息主要来自FDA的警告信和其他的监管发文。曾被召回的产品类型主要包括：Aminocarproic糖浆、硫酸钡、阿米卡糖浆、Dial brand dialyte concentrate 、电解质溶液、干性护肤霜、酸性洗液、护肤霜、Preparation H软膏、Penecare乳液、Aidex 喷雾、药妆棉片、口服混悬液、VE绵羊油乳液、绵羊油身体乳、氟化钠漱口水、碳酸氢盐悬浮液、氨苄西林悬浮液、孕酮霜。 受影响的产品与不同类型的真菌有关。由于生产环境（地理位置等）和产品成分的差异，可能会造成某一些真菌菌种的生长超过另一些菌种。在一些案例中，产品污染菌与环境中分离到的真菌有一定的相关性。 与洁净室相关的真菌类型 文章作者根据国际文献总结了药品洁净室和药品中主要的真菌类型。虽然存在一定的区域性差异，但是真菌类型仍然存在着普遍的相似性。 这些真菌在外界环境中普遍存在且通过气流扩散。 小编：跟我们在2017-2018年年度报告中的分析到的常见真菌检出类型基本一致（传送门） 对于进入制药环境的真菌，我们最关注的就是孢子的产生。真菌孢子是微小的生物颗粒，真菌产生孢子的原因有两个：第一个原因是真菌的繁殖需要，这个功能与植物的种子类似——尽管它们的机制不同。这些孢子的名称根据真菌的类型和生理状态的不同而不同。例如：孢囊孢子、接合孢子、子囊孢子等等。真菌通常根据其产孢结构分类，例如，子囊菌纲（ascomycetes）的特征就是孢子由一个子囊产生。子囊孢子的子囊是一个类似于“豌豆荚”的结构，它将孢子始终保持在最佳环境下，直到孢子被释放出来（包括酵母菌的孢子）。 真菌产生孢子的第二个原因是有一些真菌可以产生被称为厚壁孢子的特殊孢子（如念珠菌属、革耳菌属和被孢霉目的各个种）。这些真菌的厚壁休眠孢子主要被用于不利条件下的生存需要。 真菌孢子易扩散性 真菌孢子可以是单细胞的，也可以是多细胞的，通过真菌复杂的生命周期发展成许多不同的阶段。例如，对于丝状真菌，其生长过程是通过产生菌丝（管状分枝），在菌丝的多个方向上同步展开（称为菌丝体）。一些菌丝分支生长到空气中，孢子在这些空中分支上形成。 真菌的孢子可以传播很远的距离。重要的是，真菌的孢子不同于细菌的孢子。细菌孢子是静态的，除非物理迁移；而真菌孢子可以随着气流进行长距离传播，这取决于真菌的类型（如孢子大小等）和当时的情况。 这意味着，对于洁净室这样的封闭空间，真菌孢子很容易散布的到处都是。 真菌孢子在洁净室中生存 洁净室环境并不一定能够为真菌孢子的生存和复苏提供理想的环境条件。干燥、结构合理且定期消杀的洁净室并不适合真菌孢子生存。由于孢子是作为真菌生存机制的一部分而产生的，如厚壁孢子，这些厚壁孢子能够更好的适应不利的环境条件（如炎热和干燥的环境条件、缺乏营养、渗透压的变化以及不利的pH值和化学物质等）。这种真菌孢子是厚壁、深色、球形、微小的生物颗粒，因此能够在洁净室等环境中生存。 在进入洁净室的所有类型的真菌孢子中，当条件有利时，一部分真菌孢子复苏或者存活，尤其是在结构不合理或者潮湿的洁净室中。例如，乙烯基塑料下面存在水，将可能导致真菌的生长繁殖。 研究表明，真菌在有水的地方可以更好的生长，存活更长的时间（当然，没有证据表明真菌能在气流中生长，或者可以利用气流促进生长）。真菌的存在和灰尘也有关联；当水和灰尘颗粒存在时，真菌存活率提高。当真菌沉降到表面时，这些环境因素加上真菌孢子就成了洁净室中的一个特殊问题。 真菌孢子是否存活，这将取决于洁净室的一系列特定条件以及洁净室所在的地理位置。在生物地理学模型中，这些受到自然选择、群落分布、群落迁移和物种形成的影响。另一个因素是真菌种类，影响生存的一般因素有：温度、水和水活度、有机物浓度、氢离子浓度、无机物浓度、空气中粒子浓度、氧化还原电位、气压、光强度、地理位置和栖息地。 环境监测要点 评估药品洁净室中的真菌情况的前提是环境监测程序能够持续的检测真菌，并且能够反映所在环境的典型情况。此外，监测数据应满足进行趋势分析的需求。在检测方面，需要考虑培养基（涉及用于采集细菌和真菌的通用琼脂平板，或特定的真菌培养基）和培养条件。这些重要的考虑因素应在环境监测计划中详细说明。 进一步的考虑是方法的选择，依靠空气监测和表面监测的双重监测方法很重要。大多数的洁净室真菌源于气生菌群，在合适的条件下或可沉降到表面（如重力作用或者气流冲击物体）。 此外，真菌也可以通过物品和人携带进入洁净室。有机物和水可以促进真菌的生长，这对真菌在表面的复苏很重要。尽管没有科学证据表明真菌能在空气生长中，但气流是传播孢子的有效媒介，开放加工环节的风险监测应侧重于对气流的监测。 制药环境的真菌污染来源 制药生产环境内存在着多个可能导致真菌污染来源。在某种程度上，这取决于生产操作的类型、环境控制的执行情况以及清洁和消毒体系的彻底性。 在洁净环境中，真菌的来源很广泛，包括门踢脚板、袋子、培养箱、盒子、记号笔、干预设备、推车轮、天花板瓷砖、维护不善的地面等，在某些情况下，还包括高压清洗设备。房间气压不足、建筑震动、设计不合理的喷淋和灯光系统也是 洁净室真菌爆发的原因。环境的变化（例如环境温度升高），加上被带进洁净室的物品，也是真菌污染爆发的可能原因。潮湿或湿润的区域是另一个在洁净环境中可以促进真菌生长的因素。 由于真菌污染的来源多种多样，必须考虑所有可能导致污染的潜在因素，包括设施设计和维护（与暖通空调相关的环境控制系统），进入洁净室的物品，人员操作规范和适当的可用于清洁和消毒的产品。 制药生产环境中的潜在真菌污染来源（鱼骨图） 对任何污染事件的评估都应该通过调查和根本原因分析来解决，有不同的技巧可以用于此类调查。为了更好的完成调查，正确的定义和描述事件或问题很重要（问“五个为什么”这个技巧在这里很有用）。随后，应确定从正常情况到关注点的时间线。风险工具如故障模式和影响分析（FEMA）和危害分析与关键点控制（HACCP）等通常是有效的，使用“是/不是”表和矛盾矩阵等方法收集信息并找出疑问，这些方法有助于区分根本原因和影响因素。这些方法是有助于呈现问题的预测方法。 接下来要更详细的探讨一些需要考虑的更常见区域和需要采取的行动。 真菌与建筑环境的关系 尽管真菌通常在洁净室不会大量存在，但洁净室的墙壁上可能存在真菌，真菌将会对通风系统构成挑战，这些区域的缺陷可能导致真菌进入。这一点很重要，因为在任何建筑中，几乎没有发现天然存在于室内的真菌，大多数在室内发现的真菌都来自于外部环境，它们通过某种机制被带入室内环境。因此，当外部群落发生变化时，室内浮游真菌群落也会发生变化。 这里有两种主要类型的缺陷：未经过滤的空气进入，比如通过有故障通风系统；随着水流进入，如管道泄漏。气流和水流都可以在相当大的范围内传播真菌孢子。 在这两类缺陷中，与空气有关的纠正措施更容易实现，前提是执行强有力的清洁和消毒措施（使用合适的杀孢子剂）。而漏水可能是由于损坏的设施结构导致，尤其是密封设备和乙烯基塑料。这种情况下，清洁和消杀活动可能会加剧真菌孢子的传播。 此外，如果水在乙烯基塑料下面流动，有可能导致真菌孢子的大范围传播。在这种情况下，水的持续存在将导致扩散的增加。尤其是水和水汽凝结可能导致大范围的枝孢霉属（Cladosporium）孢子污染。 除了产品污染风险外，大多数环境相关的真菌也会给操作者带来健康风险。例如，真菌毒素、微生物挥发性有机物、释放到室内的微粒都有可能成为过敏原。 生产环境的现状 生产环境的现状与管道破损情况和企业通过有效的清洁和消毒程序应对事故的反应能力有关（因为损坏的表面更难清洁和消毒）。发生这种情况的可能性取决于对特定设施的维护情况，虽然随着设施的老化，良好的维护变的更加困难（在制药领域，一般超过25年的设施可能被定义为老化）。 此外，与水和温度一样，对真菌的影响因素还包括室内的高湿度及有限的通风。较高的通风率降低了真菌的持留，同时需要考虑给予建筑组件温湿性能。 生产设备的保养 维护不善的设备也可能是真菌来源之一，修复破损设备也应该成为设施真菌防御策略的一部分。例如，过滤器磨损或损坏，可能造成设施空气泄漏。 另外一个关注点是后续维护活动，例如打开机器上的面板，设备的内部区域，特别是那些通常不会暴露在洁净室环境中的区域，可能是污染源。 生产人员 生产人员通常应受过良好的培训，但可能出现与个人卫生有关的问题（与进入设施有关，如在第一换衣区脱掉室外衣服和洗手）。真菌的水平和人体皮肤的固有微生物群落有关。人员会通过带入土壤引入污染，特别在鞋子上。更换受控的鞋子进入洁净室区域是一件特别重要的事情（加上穿防潮的洁净室袜子），同时穿着合适的洁净室服装、手套和口罩。其他人员变量主要与清洁和消毒的有效性有关，特别是当采用临时工（合同工）进行这类活动时。这些人员活动行为应当通过培训加以规范。 特定真菌的检测 对真菌的鉴定有时候可以提供关于其来源的线索，源于空气、建筑环境和水等。这使得鉴定变得很重要，无论是通过视觉手段鉴定还是通过微生物鉴定系统。虽然世界上只有一小部分真菌种类被描绘出来，但是通过鉴定，我们发现那些可能在洁净生产环境中被发现的真菌也属于一个狭小的类群。 鉴定的方法包括对培养基上生长的菌落进行形态观察，与手册进行对比；表型鉴定系统；基因型方法，如检测大核糖体亚基（LSU）的D1/D2区域或者内部转录间隔区（ITS1/ITS2）。 小编：常见洁净室真菌： 常见环境真菌——青霉属和曲霉属 建筑和潮湿环境——芽枝霉属 人源——曲霉属、青霉属、Trychophyton（毛癣菌属） 当然，鉴于许多真菌的普遍存在性，这些结论并不是确凿无疑的。对洁净室微生物菌群的定期回顾可以为任何分离到的真菌在常规的环境微生物菌落中的占比高低提供线索。这类回顾对于消毒剂的效果验证实验也非常重要。 纠正措施 大体上有两种纠正措施：第一是发现问题的根源并加以纠正；第二是修复问题区域，包括进行维修和运行有效的清洁和消毒制度。后者涉及到最佳消毒剂类型的选择-其中一种是杀孢子剂，并已证明其对清除（设备/环境）表面真菌孢子的效果。 在对问题响应的方面，一个常见的问题的潮湿区域或者因漏水而受损的区域。洁净室人员应迅速对设施内的漏水情况作出反应，尽快修复或者更换损坏的墙壁和天花板。 真菌孢子对许多化学物质都有抗性。真菌细胞可能对一种或多种常用的杀菌剂具有通透性屏障的固有能力。理论上，真菌孢子比细菌内生孢子更容易杀死，然而实际上并非总是如此。有些真菌能分泌酶，干扰特定的消毒剂并使其失活。此外，如果一个区域有真菌存在，那么真菌孢子通常比细菌多得多，因而对清洁和消杀的挑战更大。为了克服这个问题，必须要进行多轮清洁和消毒。 清洁和消毒的关键： a) 使用有效的清洁剂。在有泥土、灰尘、碎片等地方，消毒剂的渗透性较差（比如像洁净室中石膏面板掉落的情况），在使用消毒剂之前，需要先进行有效的清洁。 b) 使用一种以上的消毒剂是明智的。 c) 选用的消毒剂必须具抗一系列真菌的能力。消灭孢子（细菌和真菌）通常更需要不同的接触时间，而不是标准消毒周期。 d) 为了杀死孢子，包括细菌和真菌，需要使用杀孢子剂。除了杀死孢子外，杀孢子剂还可以杀死所有的营养细胞。 e） 消毒剂需要在规定的接触时间内，在有效的温度范围内使用。反复擦拭，可以提高消毒剂的效果。 合适的消毒剂类型包括含氯类或者过氧乙酸类，或过氧化氢，或过氧乙酸和过氧化氢的混合物。在消毒剂能够达到有机体并有足够接触时间的情况下，目前没有已知的因素表明，洁净环境表面的普通真菌能够抵抗消毒剂。 影响消毒剂对真菌（以及对细菌内孢子）的有效性的一些因素有： a) 该药剂的固有生物杀灭活性； b) 消毒剂的浓度； c) 接触时间。接触时间可能会因为洁净室的不同而有所不同。一些高气流的洁净室的换气效率比其他洁净室快，这可能导致杀孢子剂干燥得更快。由于干燥速度更快，可能需要重新涂抹。 d) 待消毒表面的性质。在不同的表面，消毒剂效果存在差异。此外，随着表面老化（形成隆起等），微生物可以黏附的更深，消毒剂可能无法有效渗透。 e) 表面的清洁度。杀孢子剂在有污垢的地方渗透能力特别差。 f) 应用方法。杀孢子剂应用于表面的方法需要明确定义。在几乎所有情况下，喷洒和擦拭比仅仅简单的喷洒更有效。 g) 表面的物化性质。（可能影响微生物表面粘附） h) 用来稀释消毒剂的水的硬度。 i) 微生物种类和数量（微生物越多，种群越难杀死）。 j) 温度。大多数杀孢子剂在低温下效果很差，比如在寒冷的房间里。 k) 稳定性。一个影响因素，关系到消毒剂被制备好后是否稳定。 通过对生产环境的微生物群落的评估来进行消毒剂效果的评价是一个好方法。 预防措施 作为纠正措施的延伸，对真菌污染更进一步的预防措施是对洁净室进行良好的设计。例如，这里的设备应具有足够的空调控制系统，例如ISO 14644 9级（欧盟GMP D级，实施中）区域的换气率至少是每小时15次，以及ISO 14644 8级（欧盟GMP C级，实施中）区域换气率每小时20次。同时，还需要考虑空气分配，以确保洁净室的所有区域都能获得新鲜和适当调节的空气，因为室内机械通风对建筑物内的微生物群落有重大影响。 此外，在生产环境中使用的织物应采用不吸水或不促进真菌生长的无孔材料。为了增加进一步的保护，可以使用一些抗真菌涂料和油漆。空调控制系统的另一方面是提供合适的温度和湿度控制，避免可能促进真菌生长的极端情况。其他设计因素包括确保设计的表面便于接近，并且表面易于清洁和消毒。 药品微生物检测人员面临的问题 尽管洁净生产环境中的真菌存在与药品召回之间的联系是明确的，但是制药企业面临的任务并不简单。这在一定程度上是由于缺乏真菌检测和鉴定等方面的经验： 据Cundell称，制药企业面临的共同问题包括： 1、在环境监测过程中对真菌的分离和趋势的关注可能不够； 2、消杀剂有效性验证可能并不能充分说明针对真菌孢子的消杀活性； 3、在产品或环境监测中发现的真菌很难被计数。许多采集到的真菌是丝状的，有带孢子孢子的气生菌丝。这种生长方式会使得以菌落方式评估真菌水平的适用性受到质疑。 4、在渗水可能促进真菌在制药设施中生长缺乏足够的认识； 5、大多数的药物微生物实验室缺乏可靠的，鉴别真菌属，特别是真菌种的能力。 需要充分注意上面的每一个问题才有助于解决洁净室中的真菌带来的问题。 总   结 对洁净室的风险可能会导致终端产品的污染，这已有案例。 对于无菌产品，在终端产品中检测到真菌构成重大风险，并将触发整个批次召回。对于非无菌产品，如果在终产品测试中检测到真菌，则需要评估该真菌是否是“不可接受”的。根据Sutton博士（2006）的说法，该风险分析至少应该包含四个独立的考虑因素。分别是：所见微生物的绝对数量，微生物的特性，产品特性和对患者的潜在影响。 这意味着评估洁净室中的真菌群落成为环境监测计划的重要组成部分，通过空气采样和表面采样。洁净室真菌起源于室外，真菌物质在室外的迁移情况足以解释所观察到的室内真菌在空气中的分布。 通过对气流的评估来确定真菌污染扩散的难易程度是必要的；对表面的评估，特别是在有机材料和水存在的地方，表明真菌存活和生长的可能性。 因此需要制定监测方法、制备平皿和培养。另一个问题是真菌的溯源、趋势分析和鉴定，因为制药企业的微生物实验室中往往缺乏有丰富经验的真菌专家。这可能导致低估真菌和产品污染事件之间的关联，并影响对洁净室和受控环境的评估。 一旦真菌被大量发现，就需要采取措施消灭真菌种群。这通常与消除水源、修复损坏和有效消毒有关。这些措施需要迅速采取，以尽量减少真菌繁殖和扩散的几率。还需要改进洁净室的设计，以帮助最大限度地减少真菌进入洁净室的可能性，并降低真菌留在受控环境的可能性。 原文：Investigating and Addressing Fungal Contamination in Pharmaceutical Cleanrooms By Tim Sandle Mar 23, 2018 6:05 am PDT “ 长按二维码 吧

前    言 近年来，越来越多的法规、文献，甚至是FDA的警告信中，都不断提及在无菌检验方法验证、清洁和消毒剂效能验证、无菌工艺验证等各种微生物相关的验证中，除了使用标准菌株以外，也应当使用企业自身环境中分离到的具有代表性的微生物进行相关的验证实验。 那么，哪些菌才具有代表性呢？ 这就需要企业对环境监测中分离到的微生物进行属和种水平的鉴定（在超限时对采集到的微生物进行鉴定，以及在未超限时进行周期性的环境微生物鉴定），并且对鉴定结果进行评估，以确定常见的微生物类型，然后根据微生物的种类特征和数量从中筛选，进行相关验证实验。 当然，环境微生物数据库建立的意义不止于此，数据库的建立有助于企业了解药品生产过程中微生物的负载情况，对于建立有效的生产过程微生物污染溯源分析体系具有极其重要的现实意义。 环境菌库的应用 我们（浙江省微生物研究所）对2017-2018年积累的环境微生物数据进行了统计和分析，样本采样点绝大部分为相关企业洁净区或其他受控环境，涵盖制药、食品、化妆品等行业，其中以制药企业为主。基于保密原因，我们并不要求企业提供详细采样地点，但通过对历史数据的分析，我们仍然发现了一些有意思的东西，与大家分享。 细菌真菌检测比例变化趋势 2018年全年真菌月度平均检出率为11.4%，这一数值高于随机抽取的10家环境微生物数据库建设情况较好的制药企业的真菌检出率（3%-6%）。对此，我们并不意外，相比于细菌多种多样的鉴定手段，真菌的鉴定手段就显得匮乏一些。因此，企业在分离到真菌时，更倾向于委托给我们鉴定。 菌群相关性分析 我们对两年来鉴定到种或属水平的菌种（细菌鉴定率为98.88%，真菌鉴定率为96.89%）进行了聚类分析。众所周知，环境中的微生物并非独立存在，各个微生物种属直接存在着复杂的互作关系。 企业在环境监测中采集到的微生物主要体现为两类关系：一类是Win-Win的互惠关系，一类是Win-lose的抑制关系；具有互惠关系的微生物倾向于共同被检出，而相互抑制的微生物则可能呈现出相反的变化趋势。 洁净环境中检出的微生物大致可以分为3类： ①与人员携带相关：如葡萄球菌属（Staphylococcus）、 微球菌属（Micrococcus）、 短杆菌属（Brevibacterium）、 莫拉氏菌属（Moraxella）、 考克氏菌属（Kocuria）、 皮肤球菌属（Kytococcus）等，生境主要与人体相关，在这些菌属的检出率上也反映出了一定的正相关性； ②与水系统相关：如罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、 鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、 甲基杆菌属（Methylobacterium）、 微杆菌属（Microbacterium）、 污泥单胞菌属（Pelomonas）等生境主要为水体，常可在水系统中以形成生物膜的积聚，到一定规模时可能造成管道堵塞。 ③与土壤相关：如芽孢杆菌属（Bacillus）、 类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、 赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus），这些菌属都具有较强的抗消杀能力，可能为该洁净室的土著菌属，也可能由物料、设备包装等因素携带进入洁净环境。 从上图，我们不难看出，不同种属的微生物之间，以某种方式联系在一起。例如，可能为同一来源的微生物具有共同检出的倾向。而定殖菌之间可能存在互惠互利的现象，从而实现在洁净室环境的持留。 优势菌种对比 我们对比了2017-2018年检出率超过1%的菌种，发现两年优势菌属和菌种均十分相似。这表明尽管地域、气候等因素对菌群结构存在一定的影响，但遵循GMP体系的受控生产环境总体是具有较高的相似性，因此环境中的优势菌构成也存在着一定的相似性。 这也表明，在持续受控的环境中，菌群结构应当是具有稳定性的。研究各个企业、各个时间这种稳定结构的变化可能有助于我们对环境微生物管控水平进行更精确，更数据化的评估。 未知菌属的分类和溯源 无论采用何种的鉴定方法，能否鉴定到种或属，其实都取决于该方法所依托的背景数据库的大小。然而无论多大的数据库均有其局限性，一旦分离到的菌未被背景数据库收录，我们就无法获得其种属信息。但是，采用基因序列方法进行微生物鉴定的优势在于，即使我们无法获得种属信息，我们依然可以依据其基因序列的相似性进行物种的划分。因此，我们对未鉴定到种属的细菌（1.12%）和真菌（3.11%）也从序列水平进行了分类。 未知细菌97%序列相似度聚类  未知真菌97%序列相似度聚类  从两年的数据中，我们根据基因序列的相似度，一共得到了细菌97%相似度水平集合113个，99%相似度水平集合218个，真菌97%相似度水平集合45个，99%相似度水平集合50个。 这个数量显然是小于我们实际的未知菌检出数量的，这意味着，有一些未知菌是多次被检出的（上图中色块大小代表97%相似度水平集合的检出频次）。这意味着，即便污染菌的鉴定结果是未知菌属，我们也可以通过序列相似度的比较，进行基因水平的溯源分析。 同时，如果对一些常见未知菌的特性进行进一步研究，可能有助于我们更好的管控生产环境的微生物风险。 特定菌属的回顾分析 除了数据统计以外，我们也可以利用历史数据运用统计学手段进行一些菌群动态趋势的预测。如下图 2017-2018年芽孢杆菌属（Bacillus）的总体平均检出率在13.8%左右，总体月度波动较小。对比单个企业的抽样数据，我们发现无菌药品生产企业的芽孢检出率普遍低于10%，一般在6%~8%之间，非无菌制剂和中药企业的检出率则根据管控情况不同存在较大波动，一般在15%~30%之间，不排除芽孢杆菌检出率较高的企业存在选择性送样的情况。 另外，我们可以依据趋势推测，在未来1-2个月的芽孢杆菌总体检出情况应当会保持在13-14%%左右，若实际数据与此出现较大偏离时，可能意味着有不受控情况出现。 后  记 制药生产环境中发现的大多数微生物是人源的革兰氏阳性杆菌和革兰氏阳性球菌，真菌则是酵母和丝状真菌，我们的数据也体现了这一点。 同时，我们也在来源于水环境的菌中，发现了一些革兰氏阴性杆菌，它们通常具有条件致病性，如粘质沙雷菌（Serratia marcescens，又称褪色沙雷氏菌）。 如果企业的水系统中有这些菌的存在，会带来极高的终产品污染风险。 我们通过数据库调取了2017-2018年肠杆菌属、粘质沙雷菌的检出数据，发现月平均检出率分别为0.6%、0.1%，这个表明目前国内企业，对这些菌的管控非常到位。 产品中污染的微生物来自于原料，环境和人员的相互作用。因此，从原材料、环境、人员和产品中分离检测并准确鉴定其中的微生物，分析微生物的特性，和变化趋势，是实现微生物风险评估和管控的基础。通过建立环境微生物数据库，确定对应企业自身产品的“不可接受微生物”列表，才能更有效地验证生产工艺或者消杀是否能够有效控制原料或者环境来源的“不可接受微生物”，避免其最终污染产品。 后 记 DE 后记 经过连续几年的制药环境微生物数据库建设实践，我们发现虽然相比于自然环境，洁净环境的微生物种类更少，优势菌群占比更高，菌群面临的生存胁迫更大，但洁净环境的微生态仍具有其独特的多样性和稳定性。 虽然存在地域差异、产品差异等因素，但各企业洁净环境中的优势菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原则”，既20%的优势菌属占总检出率的80%。 这使得我们利用已知环境微生物数据来评价环境微生物数据库建设情况，通过优势菌群的变化来指导微生物管控计划，通过数据库来比较不同企业间的微生物管控水平成为可能。 推荐阅读： 【年度报告】2017年度菌种鉴定分析报告 【佛系验证】数据说话，工作菌株为什么只要求5代内 【正经研究】中药饮片微生物快速检测技术研究及风险评估方法初探 【正经研究】超纯水系统的微生物威胁 【深度文章】沙门氏菌选择性培养基中疑似菌落探讨

引言 微生物鉴定通常应用于筛查产品中的有害生物、分析环境微生物菌群以及超限事件的溯源分析，是微生物学职能的重要组成部分。每个微生物实验室都应该开发特定的鉴定策略，包括鉴定对象、鉴定时间、鉴定水平以及鉴定方法。 制药微生物学的很多内容均被列在监管机构发布的指导文件或者纲要中，包括对中间产品和成品的生物负载评估的重要性，以及使用规范方法监测环境的必要性，但是有关微生物的鉴定尚未明确。基于微生物表型或基因型的鉴定方法已经建立，方法的选择取决于鉴定的内容，需要仔细分析以确定鉴定什么类型的样品，哪种鉴定水平是合适的（形态学、属或种），以及如何利用已收集的信息。另一个决策点在于鉴定是在实验室内部进行，还是外包出去。本文对以上这些要点进行了阐述，并为每个制药或医疗组织的微生物学家提供了开发微生物鉴定策略的基础。 微生物鉴定 微生物鉴定可以被定义为“通过预先选择并适合于所研究问题的有限范围的测试进行微生物表征”。有一系列的技术可以用于微生物鉴定，可追溯到Christian Gram的开创性差异细胞壁染色，并扩展到最近的分子生物学技术。 微生物鉴定的目的是将一种微生物分离株与另外一种分离株区分开来，并将该分离株归类于科（属）和种（这是在表型鉴定可以达到的最佳水平），甚至是特定的菌株（通过基因型鉴定；菌株是微生物的遗传变异体或亚型）。 微生物学的主要分类学术语是： Family（科）：一组相关的菌属 Genus（属）：一组相关的菌种 Species（种）：一组相关的菌株 Type：种内的一组菌株（例如生物型，血清型）； Strain：特定种中的一个品系或分离株 鉴定可以被认为是推定的（给出可能的属的指示）或确认的（指定到种水平的情况下）。确认的鉴定结果最常用种名称表示（例如，Pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞杆菌）。种名通常包括两部分——属名（Pseudomonas）和种名（aeruginosa）。同样以假单胞菌为例，有时候种无法确定，鉴定结果为"Pseudomonas species"，缩写为“Pseudomonas sp.”。（通常情况下，"sp."用于单数，"spp."用于复数。） 商业化的微生物鉴定系统可以分为表型和基因型两大类，此外，蛋白质组学有时也会单独划分为一类，但是也有些文章认为蛋白质会受外界环境的影响，会把其归为表型一类。基因型和表型的区别在于遗传上（遗传信息）。“基因型”是指生物的全部遗传物质（基因）组成，不论表达与否；“表型”是指生物体个别或少数性状以至全部性状的表现，例如形态、发育或者行为。在不同的环境下，表型会随着环境条件发生改变。例如，微生物菌落在两种培养基上会呈现不同的颜色，具体的表型变化如表1： 表1. 用于微生物鉴定的表型特征 表型方法 对于许多实验室来说，表型方法的成本相对较低，应用最为普遍。微生物的表型包括细胞的大小和形状、细胞组成、抗原性、生化活动以及对抗菌剂等的敏感性，通常取决于所使用的培养基和生长条件。此外，表型反应通常包括对不同化学物质或不同生化标志物的反应。表型方法基于相对较少的观察和测试能够鉴定到属或种水平，这些方法主要依赖于微生物的培养并且要从单菌落的纯培养物开始。传统的生理生化鉴定实验操作复杂，往往还会出现人为误差，影响鉴定结果的重复性和再现性，自动化设备的出现改善了这一状况。 表型鉴定方法一般从染色开始，如革兰氏染色、真菌或细菌内生孢子的特定染色。在比较鉴定和差异的最终结果时，革兰氏染色的结果可以帮助研究者进行有效地错误排查。此外，其他有用的信息源自肉眼可见的菌落形态，例如菌落形成和色素沉着。标准菌落外观的描述可以作为鉴定的有效补充，例如菌落轮廓、表面外观、气味、菌落高度、半透明度和颜色。 补充测试同样可以辅助鉴定，其可用于代替或支持自动化方法（有些是自动鉴定测试系统的组成部分），补充测试的结果可以帮助评估鉴定是否有效。表型方法主要的补充测试列举如下：  过氧化氢酶 该试验用于鉴定具有过氧化氢酶的细菌，此类细菌能催化过氧化氢的分解并伴随着氧气的释放，继而出现气泡。过氧化氢酶试验通常用于区别葡萄球菌（Staphylococci）, 微球菌（Micrococci）和 链球菌（Streptococci）。它还可以用作补充测试，以区分不能合成过氧化氢酶的严格厌氧细菌。 氧化酶 该试验旨在检测是否存在细胞色素电子传递系统相关的氧化酶。具有氧化酶的细菌，首先氧化细胞色素C，再由氧化型细胞色素C氧化对苯二胺，生成有色的醌类化合物。 凝固酶 该试验用于从葡萄球菌属中区分金黄色葡萄球菌和其他菌种，例如中间葡萄球菌（Staphylococcus intermedius）。诊断试剂盒通过测试不同微生物凝集特殊涂层乳胶颗粒的能力，判断待测菌种是否具有凝固酶/A蛋白（一种热稳定肠毒素）以达到区分的目的。 溶葡球菌酶 溶葡萄球菌素是一种通过细胞裂解可以区分葡萄球菌和微球菌的酶，与未被裂解的微球菌相比，葡萄球菌属细胞壁被裂解，细菌悬液浊度下降或变清。 运动性（motility） 一些杆状细菌可以通过鞭毛进行运动，运动性测试可以利用显微镜或者宏观方法（借助特殊的培养基）来观察不同微生物的形态，以确定它们是否运动。微观方法还可以区分真正运动的细菌和布朗运动的细菌。 氧化-发酵（Oxidative-Fermentative） 该试验使用以葡萄糖为碳源并含有pH指示剂的专门培养基，随着葡萄糖发酵，pH降低并且发生颜色变化，能够将细菌分为有氧（氧化）代谢、无氧（发酵）葡萄糖或两种代谢方式都具备的细菌。该测试主要用于鉴定革兰氏阴性细菌。 选择性琼脂上的生长 特殊培养基用来培养和区分不同的微生物群。有许多类型的选择性培养基可用，例如MacConkey琼脂培养基，它含有胆汁盐和乳糖，促进肠道细菌的生长，抑制非肠道细菌的生长。 选择性生长要求 厌氧 a）严格好氧菌-在有氧条件下生长 b）严格厌氧菌-在无氧和其他气体存在的条件下生长 c）兼性厌氧菌或好氧菌-在有氧或无氧环境下均能生长，在一种状态下生长状况良好，另外一种状态下也可以维持生存 必要时，可以作为鉴定或培养过程的一部分，使用专门的气罐进行评估。 温度 各类细菌对温度的要求不同，在制药环境中分离的许多微生物是嗜温的（生长范围在20-40°C）。其他的微生物具有特殊的温度要求，例如嗜热菌、嗜冷菌等。 溶血 溶血是指由某些细菌毒素裂解红细胞，血红蛋白逸出，其主要有两种：一种传代培养在血琼脂上时在菌落周围产生大而清晰的光晕，这是由称为溶血素的细菌毒素引起的（β-溶血）；另外一种产生琼脂的绿化或褐变，是由镁离子的缺失和琼脂的变色引起的（α-溶血）。该试验主要用来区分葡萄球菌属（Staphylococci）和链球菌属（Streptococci）。 生化测试系统 生化检测方法成本低，是最为常见也是最经典的检测系统，其中研究细胞的酶活性是鉴定细菌的强有力试验。许多生化测试的基础是细菌能够使用不同的碳源来获得维持生命所需的能量，例如，BBL-Crystal system自动微生物鉴定系统或API鉴定系统。 很多实验室现在采用半自动化表型鉴定系统，例如VITEK（含有多种生化反应孔的检测卡）或者OmniLog（利用微孔鉴定板的小型化系统）。这种表型方法是通过排除法工作的，如果测试中A是阳性而B 为阴性，则选择一组可能的微生物，而排除另外一组，随后测试C和D，以此类推。该测试结果将会与基于二叉式检索表的数据库进行比对。另一种方法是使用气相色谱分析细胞脂肪酸，其中脂肪酸酯的模式通过气相色谱法测定。通过气相色谱（GC-FAME）进行的脂肪酸甲酯分析在环境和临床微生物的鉴定中已经应用多年，但是在制药环境微生物领域应用并不常见。 另外，近年来，流式细胞计数和基于蛋白质图谱的MALDI-TOF技术也被应用微生物的鉴定。 基因型方法 基因型方法具有不同类型微生物的数据库，其不依赖于微生物的分离培养基或生长特征。基因型方法开辟了一整套新的种和亚种，并对亲缘关系相近的种进行再分类，通过表型相似性聚集在一起的分类单元很可能是多系群（polyphyletic groups）。基因型方法包括杂交和测序（最常见的是16S rRNA）。通过分析DNA-DNA同源性或来自不同细菌的两条DNA结合（杂交）的程度如何，以确定两种微生物的亲缘关系。 选择测序检测基因组中16S rRNA区域的方法的原因是： 1）它具有普遍性，存在于几乎所有原核生物中； 2）它高度保守，随着时间的推移，16S rRNA基因的功能没有改变，表明随机序列的变化是对进化时间更准确的衡量标准； 3）16S rRNA基因足够大，可用于信息学分析。 对于丝状真菌的鉴定，可能需要更昂贵的方法，例如，基于PCR的内部转录间隔区（ITS）的测序。一些更新的技术也取得了进展，例如用于真菌感染检测的β-D-葡聚糖检测，（1-3）-β-D-葡聚糖占真菌细胞壁成分的50%以上，是真菌细胞壁的特有成分，其可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固；Riobprinter是一种全自动微生物基因指纹鉴定系统，以微生物独特的基因组为基础，可自动化同步完成菌株水平的鉴定和分子分型 。 另外一种快速方法是聚合酶链式反应（PCR）系统，PCR技术使用DNA聚合酶扩增特定的DNA片段，通过扩增“细菌条形码”形式的基因序列，利用凝胶电泳分离并可视化以产生对该菌株特异的“条形码”。通过比较测试，可以定量地检测不同生物之间DNA序列的差异，从而构建系统发育树以说明生物之间可能的进化相关性。 鉴定方法选择 微生物学实验室需要决定是否进行基本检测（如差异染色）、表型检测或基因型检测，这通常取决于： a)鉴定量 b)鉴定水平 c)鉴定成本 药品生产者需要综合考虑以上因素并决定鉴定在实验室内部进行或者外包给其他实验室。对于内部鉴定，如果每个月有20-30个鉴定，出于成本效益的考虑，通常会选择半自动化方法。由于成本和复杂性，很少有实验室在内部进行基因型检测，但是当需要这种鉴定时（例如，调查无菌试验失败），基因型检测可以考虑选择合适的供应商。 鉴定方法验证 微生物鉴定方法在引入实验室之前的验证是非常有必要的。例如通常要包括代表性的参考微生物进行验证，人员的重复性以及不同实验室之间的比较。 鉴定方法审查 使用自动化系统降低了进行微生物鉴定所需的技能水平，但是有经验的微生物学家对结果的解释仍然很重要。一个常见的监管问题是数据审查不够充分，未能对非典型的鉴定结果提出质疑。环境里回复到炭疽芽孢杆菌时（与蜡样芽孢杆菌非常接近），制药微生物学实验室应该对这一结果提出质疑。分离到无害的生物也是如此：如果复原的生物体通常与热带昆虫有关，那么需要考虑实验室是否真的有可能回复到它？这种情况下应该启动重新鉴定。如果初始筛选操作不正确，例如革兰氏染色、鉴定试剂盒或者卡片的错误使用、过度依赖于一个单一的鉴定系统，都有可能会发生这样的问题。 微生物鉴定策略 建立适当的区分水平是鉴定策略的重要考虑因素，这有助于微生物工作人员决定该鉴定哪些样品以及可以如何使用数据。审查结果应采取议定程序的形式，以便在实验室内建立一致的程序。如果在GMP检查期间提出问题，书面的议定程序提供了与监管机构讨论的途径。 鉴定水平 鉴定方法的选取基于微生物学家的需求。在某些情况下，知道微生物是革兰氏阳性菌就足够了。在其他情况下，微生物学家可以通过表型鉴定来了解微生物的一般情况，评估生物是否有害（不可接受）或者表示失控。在特定的情况下，例如无菌试验失败或者在无菌灌装实验和操作者之间获得明确联系的情况下，可能需要通过分子手段找到无菌试验污染物和洁净室生物之间的联系。 在对微生物偏离的研究中，了解微生物的类型可以提供关于其来源的宝贵信息。例如，许多革兰氏阳性球菌是人体皮肤菌群的一部分。革兰氏阳性杆菌可以通过设备和鞋类转移到洁净区域，革兰氏阴性杆菌通常与水源相关。收集这些数据可以提供以下帮助： a)确定从产品或制造环境中分离出的微生物的来源； b)帮助进行产品安全风险评估，例如非无菌产品的潜在污染，与无菌加工区内的侵入有关的污染； c)确定“典型”微生物概况的任何变化。 然而，需要鉴定的水平（例如镜检、属或种）将根据所测位置或产品的关键程度而变化。此时，不一定都需要鉴定到种水平。例如，对于从低风险区域（例如未分类的房间和饮用水）采集的样本，可以采用简单的形态描述和革兰氏染色。以下情况需要到属或种水平的更详细的鉴定：较高风险的分离株（例如来自于原料或成品的分离株）；超过行动限（定义为可能造成危害的阈值）；来自于高等级洁净室的分离株（例如所有无菌灌装分离株）。 通过对生物体进行简单分组，可以获得非常宝贵的信息，如下表2： 表2. 可以从微生物形态学中收集到的信息 对于非无菌药物，在审查环境监测时，通常不需要基于代谢反应的表型鉴定之外的鉴定水平。然而，无菌产品制造商的高等级洁净室则需要更高的鉴定水平，可以对关键样品进行基因型鉴定，例如无菌测试失败或来自过程模拟试验的阳性容器。此外，在进行无菌灌装的限度调查时，可以通过对不同分离株进行表征以确定它们是否相关。 因此，鉴定水平依赖于区域（无菌或者非无菌生产）和样本类型。尽管没有“通用方法”，但是一些重要的场景下可能需要着重考虑： 制药用水系统：低于警戒线时可以定期进行微生物鉴定以建立典型的污染特征。超过警戒线时候尤其要注意，如果是革兰氏阴性，表示存在与水有关的污染，当相关计数构成上升趋势的一部分时，进行物种鉴定。达到或者超过行动限时，由于生物可能是通过外部环境污染而产生的，例如由于管理不善导致的出口管道的污染；或者是由如取样和试验过程中无菌技术操作不当引起。革兰氏阳性菌的鉴定结果提供的信息有限。应对所有革兰氏阴性菌进行种水平鉴定，判断其是否为有害生物，这些信息对于用于配制非无菌产品的水尤为重要。 无菌生产：鉴于大多数设施采用1 CFU作为行动级别，“低于警告和行动级别”不适用于A级区域。B级区“低于警告和行动级别”，但是A级区检测到污染并且需要进行比较，B级区分离到的样品进行鉴定是十分必要的。A级区域超过行动限时，必须进行微生物鉴定，分子手段是首选，并需要对关联环境分离到的微生生物样本进行充分鉴定和比较，分析污染的关联性。 无菌检验：包括从测试环境和无菌灌装过程中回收的任何微生物都应进行物种鉴定。 非无菌产品：超过阈值，对有害生物进行初步筛查是非常有必要的。并非所有非无菌产品都类似，因为风险取决于水活度等关键因素。当水活度低于大多数微生物不能生长的点（例如Aw＜0.6）时，风险相对较低；但当Aw≥0.8时，鉴定的重要性和对准确性要求增加（这取决于产品特定的风险评估）。对于0.9及以上的水分活度，建议对所有高频的微生物进行鉴定。 微生物群落回顾 通常情况下，对从指定系统中收集的微生物群落进行定期回顾是个很好的做法。对这些收集的数据进行趋势分析并研究非典型模式，了解不同微生物的潜在来源也有助于调查微生物的偏差，并有可能发现： a）可能的污染源。例如，许多革兰氏阳性球菌是人类皮肤菌群的一部分，革兰氏阳性杆菌可以通过设备和鞋类转移到洁净区域，革兰氏阴性杆菌通常与水源相关。这些特征对于许多根源分析是很重要的，例如，将污染从表面和中间产品关联，确定是否可能由人员干预引起污染，或推断无菌测试失败是由于产品污染还是假阳性。 b）鉴定还可以辅助筛查不可接受微生物。微生物对产品质量属性的影响将取决于产品的预期或潜在应用，生产方法以及后续处理。通过鉴定获得的信息可用于与产品配方进行对照发现潜在的问题。如果微生物有可能降解产品，降低其稳定性，那它也是不可接受的。以下一些因素可以用来评估微生物在该过程中存活的可能性（这些因素首先由Halls提出并由Sutton进一步发展形成清单，该清单并非详尽无遗，微生物学家们都应制定自己的风险评估标准）: ★pH（细菌对不同pH的耐受性远高于人体耐受性） ★盐浓度 ★糖浓度 ★水分 ★温度 ★时间 同样地，这样的信息一定程度的反映了污染微生物存活或者繁殖的可能性。例如在以下条件下，微生物生存率通常较低： ★低或高pH ★高盐（高渗） ★高糖（高渗） ★水分少 ★高温（45°C以上） ★低温（10°C以下） ★存在冷冻步骤 但是，上述列表中的因素还取决于微生物物种。第二个清单上的不利条件也可能会对于某些特定的微生物来说，是生长或存活的最佳条件。 c）此外，监测微生物趋势的变化可以指示清洁区域环境中可能出现的问题，例如清洁和消毒标准的降低，可能与操作员技术或消毒剂制备有关；产芽孢细菌的增加可能表明选择消毒剂或其应用方式存在问题。 d） 关于上述问题，推荐定期用设备分离株测试消毒剂。分析最常见的微生物类型或在评估风险时可能对消毒剂的挑战更大。 e）选择用于生长促进测试的微生物。监管期望是用于促进生长测试微生物培养基的测试组中包含环境分离株（或“野生型”）。许多公司将选择两到四种微生物，并将其添加到药典推荐的培养基列表中。在设定频率下，根据微生物群落概貌，在必要时对这些生物进行审查和替换。 总结 本文概述了微生物鉴定策略的基础以及一些可采用的不同类型的微生物鉴定技术。鉴定技术包括表型和基因型方法。对于任何微生物鉴定系统，尤其是在对系统发育和表型系统进行比较时，通常是基于不同方法和不同数据库相结合的结果。因此，一些微生物学家认为，正确表征微生物的唯一方法是通过“多相方法”-多种方法相结合，例如将表型法和基因型方法相结合。 无论选择哪种鉴定方法，实验室都必须具有使用该系统的能力，与已知微生物的鉴定保持一致，包括本地分离株，以确保在常规分析中进行的任何鉴定都是有效的。对分析研究人员而言，应该通过鉴定已知的本地微生物群落和参考微生物来进行日常验证。外包鉴定时，应当包括适当的技术协议和质量职能部门批准的设施，还应当考虑授权问题。 在概述微生物鉴定策略时，本文提供了许多关于鉴定水平的建议，目的是提供一个框架，不同的组织可以从中构建自己的模式。在制定方法时，重要的是考虑以下问题：鉴定的目的是什么？微生物工作者要了解什么？微生物工作者从结果中能获得什么信息？这些问题有助于选择合适的微生物鉴定试验并制定鉴定准则。 “ 长按二维码 吧

人生的无数种可能，散落在各个地方，需要我们去远走，去发现。为丰富职工业余活动，加强团队凝聚力、向心力和战斗力，浙江天科于5月27日—30日期间开展了2023年度疗休养活动。活动组织全体员工前往安徽黄山，欣赏皖南山水，感受当地人文情怀。 TRAVEL Day 1       5月27日上午八点出发，一行人驱车三小时后抵达目的地。在徽州特色佳肴的款待下，大伙儿酒足饭饱，午后一同前往徽州府，走在古色古香的白墙青石间，聆听当地历史名人典故，品味历史长河中曾经流行一时的徽派文化。 TRAVEL Day 2       来了黄山，当然要去爬一爬黄山，感受一下“五岳归来不看山，黄山归来不看岳”的雄壮气魄。第二天，大家便兴致勃勃地踏上了黄山风景区的征程。       虽然中途有人体力不支，但始终没有人打退堂鼓，大家互相鼓励，勇往直前，欣赏黄山雄奇险峻的奇峰异石，气势恢宏的松涛云海，登高望远，不枉此行。 跋涉途中四周也不乏繁盛可爱的生灵万物       一路上大家都热心地分享背包里带的矿泉水、零食，互帮互助，帮忙背行李，一起等候掉队的朋友，大伙齐心协力，携手登峰。 “ 即使耗时5小时抵达山顶酒店时，大家都已经精疲力尽，但也不能错过山顶恢弘的落日。 TRAVEL Day 3 来都来了 不看一场日出好像有点亏       当大伙儿都沉浸在梦中养精蓄锐时，日出小分队已经裹好大衣，打着手电筒，扛着设备，披星戴月地前往山顶眺台了。       结束山上两天一夜的行程后，下山开启夜生活的正确打开方式——逛屯溪老街和黎阳老街，酒吧、冷饮、小吃、夜宵、特产一条街，大家优哉游哉地散步闹市中，好像忘却了白天登山时身上的酸痛感。 TRAVEL Day 4       最后一天，我们前往宏村观赏了徽派建筑，远看整洁雅致的白墙黛瓦青石板；近看鳞次栉比的马头墙，精妙细致的镂空石雕，栩栩如生的门楣木雕，在细节之处体会前人的“工匠精神”。       本次疗休养活既增进了同事间的相互了解，也放松了大家的心情，同时响应“健康中国”理念，借此机会呼吁全体员工加强锻炼，强健体魄、磨炼意志，未来继续保持良好的身体素质和精神面貌，积极投入到日常工作中去。 微信号｜微生物研究所

DOI：10.1038/s41587-019-0156-5 Published：2019.06.24 IF：45.117   //         细菌性下呼吸道感染(LRIs)临床诊断的黄金标准是培养周期长、敏感性较差，因此无法在早期指导有针对性的抗菌治疗。相较于培养方式，宏基因组测序可以更快地鉴定LRI病原体，但是需要一些方法来去除样品中存在的大量人类DNA。       相关研究开发了一种用于细菌性下呼吸道感染(LRI)诊断的宏基因组学方法，利用将基于皂苷的宿主DNA去除与Nanopore测序相结合。该研究首先对40个样品进行了可行性分析，方法优化后，在另外41个样品中进行测试。与培养法相比，此优化方法(从样品到结果6小时)对病原体检测的敏感性为96.6％，特异性为41.7％，并且可以准确地检测抗生素抗性基因。进一步通过定量PCR和病原体特异性基因分析的确认，特异性和灵敏度均提高到100％。 LRIs诊断和治疗的迫切性和挑战       现状：LRIs在2016年造成全球至少300万人死亡，它们可以细分为社区获得性肺炎(CAP)、医院获得性肺炎(HAP)、支气管炎、细支气管炎和气管炎。发病率和死亡率取决于感染部位、病原体和宿主因素。在英国，CAP导致每年约29,000人死亡；在美国，HAP导致每年约36,000人死亡。最常见的细菌性CAP病原体是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，最常见的HAP病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肠杆菌科 (Enterobacterlaceae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。然而，多种细菌和病毒病原体可引起LRI，这使得诊断和治疗成为一项挑战。       应对这种挑战，宏基因组测序具有得天独厚的优势，相比于传统鉴定方法，其具有周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势，而且宏基因组测序克服了很多不能培养的微生物的弊端，被越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是未知病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代和三代测序。相较于二代测序鉴定存在从样本到结果的周期较长，测序读长短等问题，三代测序(如Nanopore测序)具有快速文库制备和实时数据采集的优势。       利用抗生素治疗：严重LRI的初始治疗通常包括经验性广谱抗生素。鉴于许多患者感染了易感细菌或病毒，广泛地“盲目”使用广谱抗生素是浪费，并且构成了不良的管理。抗菌治疗会破坏肠道菌群，并可能导致耐药细菌和艰难梭菌的出现。Nanopore宏基因组学可以快速准确地表征细菌LRI，减少过量使用广谱抗生素。       病原体的识别：此外，“黄金标准”培养和药敏试验太慢，周期较长，通常为48-72小时，并且临床敏感性低。分子手段可以在几个小时内识别病原体及其抗生素耐药性，实现早期靶向治疗并支持抗生素管理。       数据分析优势：虽然核酸扩增试验(包括PCR)是快速且高度特异性/敏感性的，但多重化存在限制，并且还不断需要更新基于PCR的方法以应对新出现的抗性基因和突变。基于宏基因组测序的方法有可能通过将速度与所有存在的微生物的全面覆盖相结合来克服培养和PCR的缺点。新一代测序平台，如Ion Torrent和Illumina，被广泛用于宏基因组测序，但它们需要在分析开始之前完成测序运行(尽管一种最近报导的LiveKraken能够在运行结束之前分析原始Illumina数据)。Nanopore具有快速文库制备和实时数据采集的优势。       无论是二代测序还是三代测序，在大多数的临床样本中，往往存在大量宿主DNA，病原体DNA只占很少一部分，因此，得到的测序数据中只有很小的一部分能够用于物种和耐药基因的鉴定，并且从大量的原始数据中通过生信方法，过滤掉宿主序列需要大量的计算能力且耗时很长，也会影响临床样本中低丰度病原体鉴定的敏感性。       Nanopore测序已被用于从临床样品中靶向鉴定病毒和细菌病原体，由于共生呼吸道菌群的存在以及宿主：病原体核酸的高比例(痰液中高达105:1)，呼吸道样本对宏基因组测序提出了严峻的挑战。Nanopore测序先前已用于两个没有去除宿主DNA的细菌性肺炎患者的样本，但绝大多数读数是人类来源的，只有一个和两个读数分别比对上感染的病原体-铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。通过去除宿主DNA，或许可以改善宏基因组学方法。虽然商业试剂盒和已发表的方法可用于去除宿主DNA，但是它们在复杂呼吸道样本中表现不佳，需要更好的方法。本研究提出了一种基于皂苷的Nanopore快速诊断方法，从临床呼吸道样本中去除高达99.99％的宿主核酸，并在6小时内识别病原体和抗生素抗性基因。 Tips：胆甾醇又称胆固醇，是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，参与形成细胞膜，皂苷与胆甾醇结合生成不溶性分子复合物，从而破坏细胞的渗透性而发生崩解，实现宿主DNA的游离。       呼吸道样本宏基因组学工作流程包括：宿主DNA去除、微生物DNA提取、文库制备、MinION测序和实时数据分析。 实验结果 1) 方法适用性测试： 对来自40名疑似细菌LRI患者的呼吸道样本进行了试验方法的测试。 5个样本中(额外)检测到未通过常规临床微生物培养的其他病原体：P8、P14、P22、P29、P30；(红) 3个样本中未检测到使用常规临床微生物培养的病原体：P3、P37、P34。(蓝) 该方法灵敏度为91.4％，特异性为100％，灵敏度和特异性计算 Clinical Calculator 1 http://vassarstats.net/clin1.html 2) 宏基因组学优化： 两个培养阳性的痰液样品用于优化实验，一个含有金黄色葡萄球菌和一个含有铜绿假单胞杆菌。       a. DNA 提取：引入样品预处理步骤——磁珠研磨，以优化裂解，去除第二次DNA酶处理并减少洗涤次数将宿主DNA去除方案从90分钟缩短至50分钟，而不影响效率。       b. 文库工作：通过将文库制备PCR延伸时间从6mins减少到4mins，通过4分钟和6分钟延伸时间产生的文库之间的微生物群落谱(具有≥0.5％分类读数的生物)的比较显示，在金黄色葡萄球菌样品中，群落中的次要成员的丰度仅有微小差异，并且平均阅读长度略微减少。 优化方法：在DNA测序前，将时间周期缩短至4h以内。 3) 检测限度： 该方法的检出限为103-105CFU/ml LoD如何计算？ 使用未感染的“正常呼吸道菌群”(NRF)的痰液样品(高和低共生菌群背景各三个重复)，在已知的细胞密度下加入连续十倍稀释的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。如果存在≥1％的分类微生物读数，则每个重复被定义为'病原体'阳性(从分析中删除了WIMP分配中q-score <20的低质量读取比对)。 在高细菌背景下，大肠杆菌的LoD(≥2/3重复阳性)被确定为100,000(105) CFU/ml，金黄色葡萄球菌的为10,000(104) CFU/ml。 在具有较低细菌背景的痰样品中，LoD较低(103金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)。 4) 模拟菌群检测： 模拟群落由呼吸道样品的临床分离株包括 S. pneumoniae, K. pneumoniae, H.influenzae, S. maltophilia and P. aeruginosa组成， 还包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株(分别为H141480453和NCTC 6571)。分别培养之后，将其混入正常痰液样本中进行模拟群落分析，结果表明：基于皂苷的宿主DNA去除方法不会无意中从常见的呼吸道病原体中去除DNA，除了肺炎链球菌(平均损失5.7倍)。解释：肺炎链球菌细胞可能在宿主DNA去除过程中裂解，或者是进行模拟群体实验时可能已经生长至静止期而裂解。 5) 优化方法测试： 与培养相比，优化方法灵敏度为96.6％，特异性为41.7％。从样品到结果的时间约为6小时，包括2小时的MinION测序。 a. 在8个样品中，检测到了除培养阳性之外的病原微生物：K. pneumoniae in S5, P. aeruginosa in S7, M. catarrhalis in S14 and S39, S. pneumoniae in S8 and S15, S. aureus in S29 and S. pyogenes in S27； b. 7个样品中，培养结果为NRF/无显著生长(NSG)，检测到多达两种潜在致病菌：H. influenzae and S. pneumoniae in S10 and S21; S. pneumoniae in S11 and S28; M. catarrhalis and H. influenzae in S12; H. influenzae in S31 and E. coli in S32； c. 4个样品中，培养方法鉴定出两种病原微生物混合感染，使用优化的方法S9仅检到一种病原微生物，而S27、S38、S41均准确检测到两种病原微生物。 使用基于病原体特异性探针的qPCR测定了不一致的结果，其增加了灵敏度(100％)和特异性(83.3％):       a. 通过qPCR证实了宏基因组学检测到的大多数其他病原体(19个中的12个)，这使得优化方法的特异性增加到83.3％       b. qPCR对铜绿假单胞菌(S9)呈阴性，将灵敏度提高至100％。 最后还有7个样本结果存在不一致，其中5个样本均为流感嗜血杆菌或肺炎链球菌是阳性的。猜测：由于基于kmer的读取分类在种的水平上可能是不可靠的，特别是当一个属中的物种高度相关或具有共享基因时，这些假阳性检测很可能是由WIMP对读数的错误分类引起的，为了克服这个问题，该研究进行了所有流感嗜血杆菌和肺炎链球菌阳性样本的pathobiont特异性基因分析(siaT和ply特异性基因分别来源于相应的参考文献中，使用minimap中的long reads数据的默认参数进行比对，并通过qualimap对比对上的reads进行量化，如果样本中包含1个以上的特异基因的拷贝，那即为阳性)。该分析证实，假阳性结果(n=5)是由k-mer错误分类引起的，并且与培养+qPCR金标准相比，宏基因组学测试灵敏度和特异性为100％。 病原特异性基因分析： 6) 抗生素抗性： 为了最大化对患者管理的影响，需要鉴定临床相关的抗生素抗性基因以及感染病原体。在这方面，目前的宏基因组学方法具有潜力但仍需要改进。 利用ARMA进行抗性基因分析，数据库为CARD，共检测到的183个抗性基因： 26：培养微生物固有的基因； 24：与所观察到的表型相吻合； 4：与所观察到的表型部分吻合； 1：不太可能与所观察到的表型吻合； 14：由于临床实验室没有测试相关药物，因此无法确认任何相关的耐药性； 16：与培养的菌株表型不匹配；42个基因不太可能来自实验室培养的物种。 42：不太可能来自实验室培养的物种； 56：可能来源于正常菌群 所开发的抗性基因检测方法的特异性和灵敏度尚未确定，因为这需要对所有细菌(病原体和共生体)进行分离和测序—这是一项令人望而却步的任务。 7) 根据参考基因组组装： 临床宏基因组学数据也可用于组装病原体基因组以供参考实验室分型。 宿主DNA去除的S16样品：在测序的前2小时内，具有47.9倍的基因组覆盖率，具有28个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至228.7倍，最终组装由22个contigs组成； 宿主DNA未去除的S16样品：在测序的前2小时内，具有3.9倍的基因组覆盖率，具有69个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至17.5倍，最终组装由33个contigs组成； 宿主DNA去除的S1样品：在测序的前2小时内，具有33.5倍的基因组覆盖率，具有83个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至165.7倍，最终组装由72个contigs组成； 宿主DNA未去除的S1样品：在测序的前2小时内，具有0.2倍的基因组覆盖率，测序48小时后，基因组覆盖率增加至1.1倍。 8) 时间点分析： 通过此方法生成的宏基因组数据的质量/深度可以直接从临床样本实时监测病原体的出现和患者与患者之间的传播以及抗菌素耐药性。 在测序的5分钟内，去除宿主DNA的S16样品具有1.6倍的基因组覆盖率，而未去除宿主DNA的对照的覆盖度为0.2倍； 5分钟后在未去除宿主DNA的样品中未检测到mecA基因，而在相同的时间点在去除宿主DNA的样品中检测到两个mecA基因alignments。 在测序的20分钟内，去除宿主DNA的S1样品具有5.7倍的基因组覆盖率，而未去除宿主DNA的对照的覆盖度为0.06倍； 在测序的2小时内未检测到未去除宿主DNA的样品中的blaTEM和dfrA17基因，并且仅检测到一个针对sul1的alignment。相反，在去除宿主DNA的样品中在测序的20分钟内检测到所有三种抗性基因，并且在2小时后，检测到47个blaTEM，37个sulf1和21个dfrA17 alignments。 强调了去除宿主DNA在快速诊断病原微生物和抗性基因中的重要性。 总结 本研究报告了利用Nanopore技术快速(6h)诊断病原体和抗生素抗性基因的宏基因组学流程。此外，通过额外的测序时间(最多48h)，可以为公共健康和感染控制应用提供足够的数据。 往期阅读推荐 [1] 制药设施老化的风险分析 [2] 霉菌和酵母到底怎么分？ [3] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人类 [4] 水系统中的细菌共聚集现象（生物膜） [5] 突击检查！细菌拉丁名双名法规则 微生物研究所 微信公众号 | 微生物研究所 扫二维码关注我们哦~

伴随着制药行业的不断发展，一项新的监管问题已跃现在人们眼前：与制药设施年份相关的风险。 图片来源：网络 在世界各地，许多较为成熟的制药设施已度过了漫长的岁月，三十年，五十年，甚至更久。相比于药企追求的新兴市场（如中国、东欧和亚洲等），北美和欧洲等区域的工厂设施更为古老，可能需要更多维护。老化的制药设施会带来各种风险，本文将就其中的一部分进行讨论。并非所有药企均会涉及这些风险，部分设施依然可以正常高效的运行，但有多数设施将会需要额外的查验与评估。 设施老化会产生一系列潜在风险，如产能升级、过时、升级时间不足、新产品线的推广、无法接受革新、微生物污染、监管问题、知识储备、验证状态、质量体系等多方面，本文将着重介绍可能引起微生物污染的相关内容： 1 设施管理不善 常用设施保养不足，导致油漆剥落或外壳破碎，会为微生物的滋生提供温床。芽孢杆菌属和真菌等产生芽孢和孢子的几率增大。 芽孢杆菌 图片来源：环境微生物图谱 2 改变设施使用方法 人员和设备使用的改变会带来潜在风险。例如专为特定人数和操作水平人员设计的设施，考虑到人员是洁净室环境下的主要污染源，如果超过原本的限度，可能会给污染控制带来新的挑战。 图片来源：网络 此外，生产设备和布局的变更会改变气流方向，特别是会对无菌处理造成影响。增加的设备会在工作空间中产生更多热量，添加的空调会造成更多热负荷。如果未适当控制环境，可能会导致人员脱落更多的皮肤，从而加重洁净室的微生物负载。另一方面，随着设备数量的增加，由于操作人员无法在设备周围频繁移动，会使工作区域更加难以清洁和消毒。空气流通不良还会带来其他风险，例如一些难以发现的真菌等。 3 结构碎片 墙体裂隙、塑料碎片、伸缩缝性能退化都可能导致微生物污染事件。这些洁净室中暴露的不清洁区域，会成为微生物居住的巢穴。因为清洁方案往往无法深入处理这些裂缝。 图片来源：原文献 另一个风险是脆弱或破损的碎片的会随着高速气流从工厂区域进入洁净室。这可能导致多种气流混合以及污染爆发的潜在后果。 定期检查和完善的维护程序可以克服这些问题，同时可以安装压缩橡胶垫圈等高质量密封件加以预防。 4 建筑空隙 相邻的洁净室或者洁净室与外界之间存在空隙，这些空隙会积聚灰尘，在灰尘中则会存在许多产孢微生物。这样的环境如果在设施改造时受到干扰，例如为扩大洁净室面积而砸穿一堵墙，就可能引起微生物污染。在改造设施时实行良好的控制措施，包括合理分区以及定期清洁和吸尘等，然后定期杀孢消毒。 图片来源：网络 在日常运行时，老化的设施需要安排更多的查验项目，寻找损坏、裂缝、漏水等情况，相对而言，资源更倾向于有计划的预防性维护。此外还需加强环境监测，以确保尽早发现污染问题并加以解决。 参考文献 Shanley, A. Aging Facilities: Aseptic Manufacturing Faces The Future, Pharmaceutical Technology, 2015; 39(14): 4-11 Sandle, T. The Risk of Bacillus cereus to Pharmaceutical Manufacturing, American Pharmaceutical Review, 2014; 17 (6): 1-6 Sandle, T. People in Cleanrooms: Understanding and Monitoring the Personnel Factor, Journal of GXP Compliance, 2014; 18 (4): 1-5 Sandle, T. Making the grade in filters, Cleanroom Technology, 2012, 20 (12): 19-20 Sandle, T. Risk Consideration for Aging Pharmaceutical Facilities, ResearchGate, 2016 at:https://www.researchgate.net/publication/303820898 往期阅读推荐 [1] 霉菌和酵母到底怎么分？ [2] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人类 [3] 水系统中的细菌共聚集现象（生物膜） [4] 突击检查！细菌拉丁名双名法规则 微生物研究所 微信公众号 | 微生物研究所 扫二维码关注我们哦~

真菌，是我们生活中最最常见的微生物，潮湿天气墙角的白毛，水果放久了表面的霉变，还有雨后从石头缝里长出来的小蘑菇，都属于真菌。真菌，百度百科里讲，是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物。 常常有人来问，某某真菌属于霉菌还是酵母啊？今天我就来盘点下这些真菌各自的区别。 酵母菌 真菌是真核异养生物，目前主要分为酵母菌、丝状真菌，也就是大家所知的霉菌以及蕈菌。酵母菌（yeasts）是一类真菌微生物的俗称，并不是专业的分类名词，目前大约有1500种，大部分属于Ascomycota门，少部分为Basidiomycota门。由于酵母菌有很多的例外，所以甚至很难对它下确切的定义。一般我们认为，酵母有以下5个特征： 1）个体一般以单细胞状态存在； 2）多数以出芽方式繁殖，也有的可行裂殖或产子囊孢子； 3）能发酵糖类而产能； 4）细胞壁常含甘露聚酶； 5）喜欢在含糖较高、酸性的水生环境中生长。 酵母菌 （图片来源：网络） 酵母的蛋白含量较高，菌体蛋白与牛肉等蛋白的氨基酸组成基本相近，营养价值很高，如果荒野求生中贝爷能找到合适的酵母菌，说不定能不用吃昆虫了~扯远了。酵母菌广泛分布在自然界中，比如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子表面，葡萄园等果园的土壤是筛选酵母菌的好去处。 酵母菌一般为单细胞，通常菌体呈圆形、卵形或者椭圆形，比细菌粗10倍，直径一般2-5μm，长5-30μm。酵母的繁殖方式有很多种，分为有性繁殖和无性繁殖：有性繁殖主要是产子囊孢子，例如酵母属（Saccharomyces）和接合酵母属（Zygosaccharomyces），无性繁殖包括芽殖（各种酵母菌都存在）、裂殖（Schizosaccharomyces）和产生无性孢子，无性孢子例如节孢子（地霉属Geotrichum）、掷孢子（掷孢酵母菌属 Sporobolomyces）、厚坦孢子（白色念珠菌 Candida albicans）等。 霉菌 霉菌（Mold）与酵母菌都属于真菌界，跟酵母菌一样，霉菌也是个俗称，一般指那些菌丝发达又不产生大型肉质子实体结构的真菌，他们通常分属真菌界的藻状菌纲、子囊菌纲、未知菌类。 霉菌能形成无数个孢子，漂浮于空气中，随风到处散布，有人测定巴黎市中心空气中的真菌孢子数目，每升空气中大约有2000个真菌孢子。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝构成，菌丝是营养体的基本单位，许多菌丝连接交织在一起成为菌丝体。菌丝可以是单细胞，即没有隔膜，也可以是多细胞，即有分隔，霉菌菌丝直径2-10μm，比杆菌、放线菌的菌丝宽几倍到十几倍。 霉菌 （图片来源：网络） 霉菌菌落质地较放线菌疏松，外观干燥不透明。菌落和培养基之间连接紧密，菌落边缘与中心，正面与反面的颜色往往不一致。最常见的霉菌包括青霉、曲霉等。曲霉属在各种环境中已经发现了几百个物种，从显微镜中看到，形态像花洒（aspergillum），所以取名叫Aspergillus。曲霉属真菌是一类具有分生孢子的真菌。是常见的淀粉类食物(如面包和土豆)的污染物，也能生长在许多植物和树木中。曲霉菌真菌可以在高渗透压的环境中生存，也可以在营养缺乏的环境中生存。青霉属为多细胞，菌丝有分隔，有分枝。分生孢子蓝绿色，能耐低湿度、高渗透压的环境。 表1 酵母菌与霉菌的比较 蕈菌 既然酵母菌和霉菌都讲了，那就顺道讲讲蕈菌。蕈菌包括了大多数担子菌和极少数的子囊菌。担子菌纲是真菌中最高级的一个纲，我们常见的蘑菇、木耳，以及云南人爱吃的那些菌子们，通通属于这一类，这可比霉菌酵母好认多了。它们的特征，就是“担子”，“担子”其实是一个特殊的产孢器，可以用来产生担孢子。担子菌的菌丝发育较好，并且有分隔，可以扩展生成扇形，菌丝体具有三个明显的发育阶段：初生菌丝、二生菌丝和三生菌丝。 初生菌丝为单倍体，由担孢子萌发而成。 二生菌丝为双核体，由2个单核细胞进行异宗配合而成。 三生菌丝也是双核体，由二生菌丝特化而来，从而形成各种子实体。当然，担子菌的繁殖也是有无性生殖和有性生殖两种的。需要提一句的是，虽然我们认为的担子菌大多数都是蘑菇类型的，但是在它还是初生菌丝、二生菌丝的时候，也可以飘到平板上被我们检出。 蕈菌 （图片来源：网络） 讲了那么多，你对霉菌和酵母会区分了吗？ 不会三者分不清了吧，其实蕈菌还是相对好区分的，毕竟大多数蕈菌都是担子菌纲的，通过天科ITS/D2真菌鉴定方法鉴定出来物种查查它的分类，就可以大体区分出来啦~ 实在搞不定的 那请务必继续来问我们哈~ 我们会想办法帮忙查资料的 往期推荐 [1] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人类 [2] 水系统中的细菌共聚集现象（生物膜） [3] 突击检查！细菌拉丁名双名法规则 [4] 【科普动画】耳朵越掏越上头，可要警惕这种菌——小M护耳记

最新资讯 据国家流感中心3月29日发布的最新监测报告显示： 2023 年第 12 周（截至3月26日），全国（未含港澳台地区，下同）流感监测网络实验室共检测流感样病例监测标本13305 份。南、北方省份检测到的流感各型别及亚型的数量如下表所示。 表1 流感样病例监测实验室检测结果 国家流感中心对144株 A(H1N1)pdm09 亚型流感毒株进行抗原性分析，其中144株（100%）为 A/Victoria/2570/2019 的类似株。 根据近几期的流感报告结果显示，这波来势汹汹的流感病毒有A型和B型两种，并以A型感染为主，包括H1N1和H3N2两种亚型。近期随着新冠疫情逐渐淡出人们的视线，不经意间流感病毒猛地冲上了一波高潮，虽然既往每年都会出现季节性流感高峰，但今年的甲流自2月底开始，到3月中旬以来持续处于高峰，与往年相比不但爆发时间迟，而且发病率也更高，引起了社会的广泛重视。面对盛行的甲流，有人表示流感盛行数十年，早已习以为常，从来不带怕的；也有中招的网友亲测表明感染甲流比新冠还受虐，一度误以为是新冠二次感染。 表2 我国近期流感数据统计表 将最近7周的流感数据汇总后，可以看到本周报告的阳性数有所下降，但实际上检测到的南方省份流感样病例百分比依然呈现上升趋势，不同于北方省份自第11周开始已经出现转折点。因此，“甲流热潮”仍未完全退散，大家还是得保护好自己，不能让甲流逮到可乘之机。 每年复出即占据热搜的“流行性感冒病毒”真有这么“潮”吗？ 实际上，流感病毒还真是持续在“迭代更新”的，不断引起流行的原因，是其抗原性在不断发生变异，自2009年被发现并命名以来，已经出现了众多类型，只不过统称为“流感”。所以这一期我们就来剖一剖流感病毒，了解一下这类病原体。 图1 流感病毒的3D图像 （图片来源：美国CDC官网） 流感病毒的形态 图2 高倍放大的数字彩色投射电子显微镜（TEM）图像下的H1N1分离株病毒成像形态 （图片来源：美国CDC官网） 流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）家族，是负链单链RNA（-ssRNA）病毒，具有多形态，有的呈丝状、有的呈杆状，但一般为球形，病毒的直径为80～120nm，内有一直径约为70nm 的电子致密核心，其实就是病毒的核衣壳。丝状体长短不一，长度有时可达几微米。 图3 流感病毒结构示意图 （图片来源：参考文献） 流感病毒的结构主要包括内部的核心（即核衣壳）和外面的包膜（即病毒囊膜）两部分其中，血凝素 (Hemagglutinin, HA)是由3条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）是由4条相同的糖基化多肽所组成的蘑菇状四聚体，两者均为表面糖蛋白，分别参与融合宿主细胞上的受体和侵入细胞后毒素释放的过程；M2离子通道蛋白被埋在来自宿主质膜的病毒包膜中，参与病毒的脱壳过程；基质M1蛋白与核糖核蛋白和病毒包膜相关。核糖核蛋白复合体中包括一个与核蛋白（nuclear protein, NP）相关的病毒RNA片段和三个聚合酶蛋白(PA, PB1和PB2)，共同参与病毒RNA的转录和复制。 流感病毒的分型 根据流感病毒核蛋白（nuclear protein, NP）和膜蛋白（membrane protein , MP）抗原决定簇的不同，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，近年来才发现的牛流感病毒归为丁（D）型，是否感染人类暂未知。其中A型病毒(IAV)和B型病毒(IBV)主要感染人类，包含8个基因片段，编码16种蛋白质。两者进一步的分型是基于血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的抗原性。IBV相对较简单，只有1种HA和NA，没有其他亚型。IAV变异性最强，是在世界上流行最广、致病性最强的病毒，可以感染广泛的动物物种，目前已鉴定出18个HA (H1-H18)亚型和11个NA (N1-N11)亚型。 图4 甲型H1N1流感病毒结构图 （图片来源：美国CDC官网） 流感病毒的致病性 HA作为IAV中最丰富的表面糖蛋白，具有附着宿主细胞的能力，引起细胞融合和病毒进入。HA的高度可变性使IAV逃脱宿主免疫监测，并导致流感季节性流行。NA是第二丰富的糖蛋白，可切割唾液酸（sialic acid，SA）部分，促进新生病毒粒子的释放，并促进IAV的分散。流感病毒依靠宿主细胞进行复制的具体步骤如下图所示。  vRNA：病毒RNA；cRNA：互补RNA 图5 流行性感冒（流感）病毒复制周期 （图片来源：参考文献） HA与细胞表面的唾液酸受体结合后，病毒颗粒被内吞进入细胞，形成内吞体。此时，离子通道蛋白M2被激活，离子通道打开，允许H+进入病毒；pH值降低到5.0时，内吞体膜与病毒包膜融合，病毒粒子中的病毒 RNA（viralRNA，vRNA）被释放到细胞质中（脱壳）。vRNA与RNA依赖性 RNA 聚合酶（RNA- dependent RNA polymerase，RdRp）被输运到细胞核进行转录和复制。合成的RNA不含mRNA所必需的帽子（Cap）结构，RdRp 的 Cap 依赖性内切酶将宿主 mRNA 的 Cap结构切除并转移到 vRNA 上，形成病毒 mRNA（抢帽反应）。vRNA 被转录成 mRNA，用于产生病毒蛋白，并通过互补RNA（complementary RNA，cRNA）进行复制。病毒蛋白和 RdRp-RNA 复合体形成病毒颗粒，随后从细胞膜上出芽。从细胞表面生长出来的病毒颗粒上的 HA 与被感染细胞表面的 SA 受体结合，NA 通过水解 SA 受体释放出病毒颗粒，成为具有感染力的新病毒。 IAV会感染气管、支气管和肺泡，并破坏上皮细胞。因此，病毒扩散到下呼吸道并造成组织损伤的能力是致命的关键因素。大多数死亡病例还患上了细菌性肺炎。目前公认呼吸衰竭的主要原因是并发细菌性肺炎导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。其特征是破坏肺泡的内皮-上皮屏障，导致液体泄漏并积聚在肺泡腔内，抑制气体交换。 流感病毒的变异 流感病毒能不断引起流感流行是因为其抗原性不断发生变异，HA 和NA 是其主要的变异基因，HA 变异最快，其次是 NA。HA 基因分子中受体结合部位、糖基化位点及连接肽氨基酸发生替换常造成流感病毒株的致病性和宿主范围的改变。NA 基因的神经氨酸酶活性位点的变异会导致酶活性的改变甚至丧失，导致病毒繁殖能力的下降。流感病毒主要通过抗原位点上氨基酸变异和HA 糖基化的方式逃避宿主中和抗体的免疫压力,使疫苗不能对机体产生有效的保护，从而造成疫苗免疫失败。 相关研究对杭州市2009-2020年期间A(H1N1)pdm09病毒的流行情况进行了统计分析，并随机选取覆盖12个连续监测年度、10次流行高峰的208株代表性流行株进行血凝素基因(HA)全序列测定，分析其基因变异情况并绘制系统发育特征图如下所示。 图6 2009—2020年杭州地区A（H1N1）pdm09亚型流感病毒HA基因的系统发育特征分析 （图片来源：参考文献） 结果显示在2009—2020 年连续12个监测年度里杭州地区的A（H1N1）pdm09流行株主要由Group1、5、6、7四个支系组成，其中Group6支系的流行最为广泛和持久。随着病毒的遗传变异，Group6支系分化为6A、6B（优势株）和6C，其中6B又衍生出6B.1和6B.2。小支系6B.1进一步分化出6B.1A，其携带S74R、S164T和1295V等多个氨基酸突变特征，成为2017年后流行的A(H1N1)pdm09病毒绝对优势株。6B.1A小支系在2017/2018冬春流行季之后再次分化为均携带S183P氨基酸突变的6B.1A1、6B.1A5和6B.1A6，并继续在本地广泛流行。 流感基因组测序方法 事实上所有的流感病毒都会随着时间的推移发生基因变化，由于流感病毒不断变化的性质，从患者身上收集的许多流感病毒彼此之间也具有微小的遗传差异。此前，研究者使用Sanger测序技术来监测流感的演变，作为基因表征的一部分。Sanger测序能够体现病毒样本中毒株的主要基因序列，但无法呈现样本中病毒数量的微小变化。而采用二代测序检测技术 (next-generation sequencing，NGS)，则大大扩展了测序分析可以提供的信息量和细节，能够检测到病毒基因的微小变异，并为全基因组测序提供了优势，流感病毒由单链RNA组成，通过全基因组测序可以揭示流感病毒基因组中大约13500个核苷酸(即A、C、G和U)序列。NGS使用先进的分子检测技术(AMD)来识别样本中每种病毒的基因序列。因此，NGS揭示了单个样本中许多不同流感病毒颗粒之间的遗传变异，并可以提高病毒每个蛋白质编码区测序的速度和准确性，对流感病毒基因变异情况的分析及对流感的预测、防控、诊断都具有重要意义。 参考文献： [1]. HORIMOTO T, KAWAOKA Y. Influenza: lessons from past pandemics, warnings from current incidents. Nat Rev Microbiol,2005,3(8): 591–600. [2]. GU Y, HSU A C, PANG Z, et al. Role of the innate cytokine storm induced by the Influenza A virus. Viral Immunol,2019,32(6): 244–251. [3]. 王江,徐轶,陈俊峰等.流感病毒实验室检测方法研究进展[J].中华医院感染学杂志,2020,30(2):308-312. [4]. 李钧,赵刚,于新芬等.大流行后杭州地区甲型H1N1流感病毒的流行及其支系更替特征分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2022,42(8):609-614. [5]. Wenjie Zheng;Yizhi Jane Tao. Structure and assembly of the influenza A virus ribonucleoprotein complex[J]. Febs Letters，2013，587(8)：000-000. 往期推荐 [1]. 水系统中的细菌共聚集现象（生物膜） [2]. 突击检查！细菌拉丁名双名法规则 [3]. 新冠病毒抗原检测来了，你了解多少？ [4]. 从2小时到15分钟？这些新冠病毒检测方法有什么区别？-检测方法更新

不少朋友可能享受掏耳朵带来的快感，隔三差五地用棉签或者掏耳勺清理耳朵，感觉解压又上头，殊不知过度的清洁反而会破坏耳道的防护屏障，给病菌带来可乘之机。 这一期就让我们走进微生物科普系列动画短片第二集《小M护耳记》，来看看爱好朋克装扮的暗黑首领——黑曲霉（Aspergillus niger），是如何在外耳道内“掀风作浪”的吧。 ，时长04:45 PS：本视频为浙江省药检院与我所合作制作的微生物科普系列视频第二集，未经许可，请勿转载。         黑曲霉是曲霉属真菌中的一个种，在生活中像一把“双刃剑”影响着我们的日常。一方面，黑曲霉以其极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势而具有较高的应用价值，常作为发酵工业菌株应用于酶制剂和有机酸的生产。另一方面，黑曲霉被划分为病原微生物中的第四类，即通常情况下不会引起人类或者动物发病，对个体危害和群体危害较低的微生物。但黑曲霉感染后的危害不容小觑，黑曲霉在免疫正常人耳真菌病中是最常见的分离菌，还可导致真菌性角膜炎及肺部感染，此外，在环境中也是导致食品或其他工业器材霉变的主要“元凶”之一。 黑曲霉的真实面目： 黑曲霉菌丛呈黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙，菌丝发达，多分枝。对紫外线以及臭氧的耐性强。分生孢子梗由特化了的厚黑曲霉壁从膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”，蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。黑曲霉的菌丝、孢子经常呈现各种颜色，如：黑、棕、绿、黄、橙、褐等，菌种不同，颜色也不同。 黑曲霉镜检形态特征 图片来源：网络 临床上曲霉感染发生率居系统性真菌感染的第二位，因此快速准确检测和鉴别曲霉具有重要的临床意义。目前曲霉鉴定方法包括传统的形态学鉴定、质谱、DNA序列分析等技术。对于广大的临床微生物实验室而言，曲霉的形态学鉴别还是目前主要的鉴定手段。 黑曲霉的培养特性： 1. 沙氏琼脂上生长快，3d内成熟。开始为白色绒毛状，逐渐菌落中央出现很淡的黄色，最后变为粗绒状黑色或黑褐色，背面无色或淡黄色。 2. 马铃薯葡萄糖琼脂上，菌落特点接近沙氏琼脂，菌落表面黑色颗粒较沙氏琼脂上菌落颗粒粗。 3. 察氏琼脂上，生长迅速，质地丝绒状或稍呈絮状，少数菌株生长较局限。表面呈暗褐黑色至炭黑色，反面无色或淡黄色。察氏琼脂上菌落相比SDA和PDA，生长稍慢，菌落表面黑色颗粒稀疏。 4. 在PDA培养基上菌落生长迅速，10-14日直径可达25-3cm，菌落初为白色，常有鲜黄色区域，厚绒状，继而黑色，背面无色或中央部分略带褐色。 黑曲霉培养菌落特征 图片来源：网络 黑曲霉属于黑色曲霉组，当黑曲霉需要作为特定菌株进行应用时，传统的形态学鉴别是难以给出充分的种水平鉴定结论的。比如黑曲霉与巴西曲霉在形态学上非常相似，两者的鉴定就需要通过表型分析技术结合基因型分析技术进行多相鉴定综合判断才能得出正确的鉴定结果。 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J树 图片来源：参考文献 在2008年，美国典型菌种保藏中心（ATCC）对ATCC16404做了复合鉴定，发现ATCC16404的表型、基因型与黑曲霉的模式菌株ATCC16888存在差异，而与巴西曲霉的模式菌株完全一致，因此ATCC16404被更名为Aspergillus brasiliensis巴西曲霉。在2010年，美国药典（USP）已经将ATCC16404由Aspergillus niger黑曲霉改名为Aspergillus brasiliensis巴西曲霉，是USP史上中第一株更名的标准菌株。 近年来，随着控制医学和农业上有害曲霉的控制和工业上有益曲霉的培养需求加大，黑曲霉相关高效基因编辑技术和分类研究的不断深入。有望通过进行基因组改造进一步开发黑曲霉的应用潜力，更广泛地应用于人们的生产生活。 参考文献 [1] Houseknecht, J., Stamenova, E., Suh, S.-0., et al. Reclassification of ATCC 16404 and ATCC 9642 as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, 14: 2-8. [2] 隋雨菲, 欧阳立明, 鲁洪中, 等. 黑曲霉组学研究进展[J]. 生物工程学报, 2016, 32(8): 1010-1025. [2] 徐和平, 黄江山. 临床常见曲霉形态学鉴定[J]. 临床检验杂志, 2017, 35(17): 758-764. [3] 张驰, 顾徽瑜, 陆玲. 曲霉高效基因编辑技术研究进展[J]. 菌物学报, 2018, 37(10): 1349-1356.